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Nuevas tecnologías en investigación básica

María Teresa Cuevas González-Nicolás
Unidad de Biología y Variabilidad del VIH. Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III.

El objetivo es dar a conocer las nuevas tecnologías que se emplean en el estudio del VIH.

1. Nuevos kits para la detección de infecciones recientes.

Un objetivo de la RIS (Red de Investigación de Sida) es la caracterización de las infecciones recientes dentro de los nuevos diagnósticos. De este modo, conoceríamos las características de los virus que producen estas nuevas infecciones y a que grupos afecta.

Gracias a la colaboración entre el Centro Nacional de Epidemiología y el Centro Nacional de Microbiología del Instituto de Salud Carlos III y con muestras del Biobanco del Hospital General Universitario Gregorio Marañón estamos realizando un estudio para detectar estas infecciones recientes. Utilizamos un kit, Sedia TM HIV-1 LAg-Avidity EIA (1), avalado por el CDC (Centers for Disease Control and Prevention) que mide la avidez de la unión del antígeno (pegado a una placa) al anticuerpo (presente en la muestra del paciente). La unión será mayor cuanto más haya progresado la infección, mientras que se obtendrá un menor valor en la densidad óptica si la infección es reciente.

2. Ultrasecuenciación aplicada al estudio de mutaciones de resistencia, tropismo y genotipado.

Con la secuenciación convencional no se detectan subpoblaciones presentes en una proporción inferior al 20%. Con la ultrasecuenciación si se detectan estas subpoblaciones. Esta técnica es muy útil en el estudio de resistencias en pacientes muy tratados y, previo al uso de Maraviroc, permite determinar el tropismo genotípico y la presencia posibles subpoblaciones con diferente tropismo. Estas dos utilidades se presentan en el trabajo de Silver y cols (2).

3. Nuevas técnicas para el estudio del ciclo viral. El problema de los reservorios.

Existen diferentes técnicas para estudiar el virus en diferentes momentos del ciclo viral, algunas de ellas permiten cuantificar el reservorio viral:
– Alu/PCR: Sirve para la detección de ADN viral integrado.
– TILDA (Tat/Rev Induced Limiting Dilution Assay): Permite cuantificar el ARN inducido tras la activación de linfocitos en reposo.
– RNA/DNA Scope: Hibridacion in situ, que permite cuantificar el ADN y/o ARN total. Para este mismo fin se puede utilizar ddPCR (digital droplet PCR).
– qVOA (q Viral Outgrowth Assay): Permite cuantificar la replicación competente del VIH.
– Single Copy Assay (SCA): detecta la replicación residual del ARN.

4. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) /Cas9, terapia génica aplicada al VIH.

Esta técnica de edición de ADN, en cuyo nacimiento participó un español, Francis Mójica, está revolucionando el trabajo en el laboratorio. Este sistema de edición, consta de una nucleasa que corta el ADN como si fuera unas tijeras moleculares y un ARN guía, que conduce a estas “tijeras” hasta el punto donde se ha de producir el corte. Posteriormente la célula se encargara de “coser” los extremos que quedan sueltos, de esta manera se puede insertar o eliminar un fragmento de ADN. Destaca el trabajo presentado por la Dr. Burdo en el último CROI (3). Construyeron un vector que contiene los elementos necesarios para que funcione esta tijera molecular y lo inoculan en primates no humanos a los que previamente han infectado con SIV (Simian Immune Deficiency Virus) y a los que han dado terapia antiretroviral, demuestran tanto ex vivo, como in vivo la eliminación del SIV.

En conclusión, contamos con mayor número de técnicas que permiten conocer mejor la infección por VIH.

Espero que la prometedora CRISPR/Cas9 permita en un futuro erradicar o disminuir no sólo los reservorios, sino la infección.

BIBLIOGRAFIA

1. Murphy G, Pilcher CD, Keating SM, Kassanjee R, Facente SN, Welte A, Grebe E, et al.; Consortium for the Evaluation and Performance of HIV Incidence Assays (CEPHIA). Moving towards a reliable HIV incidence test – current status, resources available, future directions and challenges . Epidemiol Infect. 2017;145(5):925-41.
2. Silver N, Paynter M, McAllister G, Atchley M, Sayir C, Short J, Winner D, et al. Characterization of minority HIV-1 drug resistant variants in the United Kingdom following the verification of a deep sequencing-based HIV-1 genotyping and tropism assay. AIDS Res Ther. 2018;
15(1):18.
3. Burdo T, Mancuso P, Kaminski R, Gordon J, Ling B, MacLean A, et al. Ex vivo and in vivo editing of the SIV genome in nonhuman primates by CRISPR/Cas9. CROI 2019. Abstract nº 24. Disponible en: http://www.croiconference.org/sessions/ex-vivo-and-vivo-editing-siv-genome-nonhuman-primates-crispr-cas9 (Consulta mayo 2019)

 

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